GFP+激發(fā)光源在細(xì)胞生物學(xué)的應(yīng)用具有易于檢測、熒光穩(wěn)定、廣譜性、易于載體構(gòu)建、無毒害諸多優(yōu)點,因為在生物學(xué)應(yīng)用廣泛,深圳熒鴻激發(fā)光源為你簡單整理10個應(yīng)用:
1、對細(xì)胞生理過程監(jiān)控
通過基因操作,蛋白與不同GFP進(jìn)行融合,形成融合蛋白。通過融合蛋白在激發(fā)光源的照射下發(fā)出熒光特制,可以對相應(yīng)蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運以及生理反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控。監(jiān)控主要有:轉(zhuǎn)移和定位、GFP光譜的生化修飾、熒光共振的能量轉(zhuǎn)移。
2、細(xì)胞篩選
基于GFP能夠吸收并在激發(fā)光源照射下發(fā)出熒光,并且熒光穩(wěn)定以及檢測方法快速、方便的特性,GFP在細(xì)胞篩選上廣泛應(yīng)用。如:應(yīng)用流失細(xì)胞計數(shù)儀來篩選蛋白產(chǎn)量增強的細(xì)胞;使用GFP作為標(biāo)記快速篩選出在生長抑制環(huán)境下仍能保持重組蛋白大量表達(dá)的CHO細(xì)胞;通過GFP熒光的減少,可以檢測出鼠和人細(xì)胞的凋亡;利用GFP融合細(xì)胞作為細(xì)胞表面活體熒光標(biāo)記,通過篩選已經(jīng)獲得GFP表達(dá)的E.coli、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞燈特殊類型。
3、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子的定位
相對于以前使用細(xì)胞分級分離和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)研究蛋白質(zhì)移位,現(xiàn)在使用GFP融合蛋白顯像技術(shù)更簡便且可靠,既能更快又能更全面的對蛋白質(zhì)的移動進(jìn)行研究。如:對幾個GFP突變體的檢定,通過激發(fā)光源激發(fā)不同熒光,從而在活細(xì)胞中準(zhǔn)備的區(qū)分多種不同熒光融合蛋白并了解他們的分布情況。
4、用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動力學(xué)研究
研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)主要有:光漂白熒光恢復(fù)法(FRAP)、光漂白熒光損失法(FLIP)。FRAP主要是通過對細(xì)胞內(nèi)特定的點或區(qū)域進(jìn)行強烈的光照,使熒光發(fā)生光跑白作用,再通過相同時間間隔的光影像采樣記錄下熒光恢復(fù)的動力學(xué)過程。FLIP是對細(xì)胞的一個區(qū)域進(jìn)行持續(xù)性的光漂白,再對光漂白區(qū)外的熒光的損失進(jìn)行監(jiān)控就可獲得一些標(biāo)記蛋白之間的相關(guān)性信息。另外一種可以用來研究細(xì)胞內(nèi)返傭動力學(xué)的方法就是熒光相關(guān)性分光光鏡檢查。
5、計算細(xì)胞生長速度
在高水平組合型表達(dá)GFP的細(xì)胞品系中,在細(xì)胞生長的對數(shù)期。綠色熒光蛋白激發(fā)后所發(fā)出的熒光信號與細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)。測量到的任何熒光強度都可以相應(yīng)地轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞濃度。盡管在細(xì)胞生長的后期,用熒光信號計算得到的細(xì)胞數(shù)目略低于培養(yǎng)物種的實際數(shù)目。但在常用的臺盼藍(lán)技術(shù)方法中,這些誤差是允許的。利用這一技術(shù),可以測定某些細(xì)胞的分布和生長狀況,尤其是一些透明的動植物組織內(nèi)特定細(xì)胞、化合物的生長、分布情況。也有人用此項技術(shù)進(jìn)行病毒在植物體內(nèi)的生長、擴(kuò)散情況的研究,取得了不錯的效果。
6、觀察細(xì)胞內(nèi)酶的活動
GFP不僅可以用來探測融合蛋白的空間定位,而且可以對活細(xì)胞的酶活動,如:磷酸化作用、蛋白水解作用燈進(jìn)行報告,還可測量與酶活動相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)的pH、cAMP、Ca2+濃度。通過將外源系列插曲GFP基因中,可以對細(xì)胞內(nèi)酶的活動進(jìn)行觀察以及了解這些酶的生理學(xué)參數(shù)。插入外源基因后所表達(dá)的融合蛋白中的GFP蛋白發(fā)色基團(tuán)會發(fā)生構(gòu)像改變,其發(fā)射的熒光的強度?發(fā)生很大的變化。這些指示劑可以用來檢測細(xì)胞內(nèi)許多酶的作用。例如:蛋白水解酶、激酶、氧化還原酶以及一些小配基的濃度。
7、用于細(xì)胞示蹤實驗研究
利用GFP的激發(fā)后發(fā)出熒光可以清楚地對腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移進(jìn)行追蹤。體內(nèi)腫瘤侵襲的研究要求在周圍正常細(xì)胞背景下,能識別少量甚至是單個的瘤細(xì)胞。
8、基因表達(dá)調(diào)控
GFP作為一種活體報告蛋白,用于研究基因表達(dá)的調(diào)控,易于會提觀測和檢測。
9、定量分析
GFP的熒光強度很高,很容易用一起定量檢測,而且研究表明GFP的熒光強度與其相連的細(xì)胞或蛋白有一定的相關(guān)性,只需要作出一條相關(guān)性曲線,就可以對研究隊形進(jìn)行定量的分析。
10、DFP報告蛋白用于細(xì)胞活體分離與純化
利用細(xì)胞表面標(biāo)記,通過流體細(xì)胞分光光度計或熒光活化細(xì)胞篩選儀可以分離與純化特殊類型細(xì)胞,對分析cDNA文庫、研究基因的細(xì)胞發(fā)育或組織專一性表達(dá)十分重要。利用GFP融合蛋白為細(xì)胞表面活體熒光標(biāo)記,通過篩選已經(jīng)獲得GFP的表達(dá)的大腸桿菌、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞特殊類型。